大咖有话说系列--dPCR的临床应用之肺癌篇
数字PCR是近几年发展起来的一种核酸定量分析技术。相较于传统荧光定量PCR来说,数字PCR对结果的判定不依赖于扩增曲线循环的Ct值,不受扩增效率的影响,直接读出DNA的拷贝数,能够对起始样本的核酸分子进行绝对定量,具有更高的灵敏度和准确性。这些独特的技术优势在肺癌的驱动基因敏感/耐药突变检测、判断预后以及液体活检等领域都显示了良好的应用前景。为此,91360智慧病理网邀请北京协和医院病理科曾瑄教授来谈谈dPCR的临床应用之肺癌篇。
大咖有话说系列--dPCR的临床应用之肺癌篇
数字PCR(Digital PCR,dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR) 之后发展起来的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元(微腔室或微滴)中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性微反应单元的比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比,dPCR技术不依赖于标准曲线即可实现靶分子的绝对定量,具有更高的灵敏度、准确度及对PCR抑制剂的高耐受性,尤其适用于微量或痕量DNA的检测与定量。这些独特的技术优势,使其在众多研究领域显示出巨大的应用前景。
本期大咖有话说关注dPCR在肺癌中的临床应用,聚焦以下问题:
1. dPCR在肺癌临床诊断中主要用于哪些方面?
» 1.1 肺癌诊断
dPCR可用于肺癌血浆异常标志物的检测,以辅助肺癌的诊断。例如miR-21-5p和miR-335-3p在肺癌患者血浆中呈现异常表达,MA等利用dPCR分析了36例肺癌患者和38例健康对照血浆中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷贝数差异。研究结果表明qPCR只能检测到血浆中miR-21-5p的拷贝数,而dPCR可同时检测到血浆中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷贝数,说明dPCR对低丰度核酸的检测更敏感。根据dPCR定量分析结果,血浆miRNA区分肺癌患者和健康对照的灵敏度和特异度分别为71.8%和80.6%。ROC曲线显示相对于qPCR,dPCR可以更准确地区分正常组织和肺癌组织。以上诊断标志物仍处于研究阶段,并未经过大规模的临床试验验证,还不能运用于临床,不过多项研究表明肺癌早筛相关血浆标志物是值得关注的未来发展方向[1]。
» 1.2 靶向治疗方案制定
多项研究表明靶向治疗药物大大改善和延长携带相应驱动基因的NSCLC患者的预后和生存,所有含腺癌成分的 NSCLC,无论其临床特征(如吸烟史,性别,种族,或其他等),应常规进行 EGFR突变、ALK 融合及 ROS1 融合检测。
Yung等用微流控dPCR检测了35例NSCLC患者治疗前的血浆标本中EGFR基因突变,并用测序方法检测患者组织中该基因突变,结果显示dPCR检测到血浆中19号外显子缺失突变和21号外显子L858R错义突变的比例分别为17%和26%。与组织检测相比,血浆EGFR基因突变分析的灵敏度和特异度分别为92%和100%。这表明dPCR可用于分析血浆中低丰度EGFR基因突变,并为临床用药提供依据[2]。
Liu等人分别使用IHC、FISH、RT-ddPCR技术对182例NSCLC标本的ALK融合情况进行了分析,其中部分标本采用NGS、RT-qPCR 及RNAscope 验证ALK的状态。结果发现IHC、FISH和NGS技术均有假阴性结果,而采用基于融合诱导的不对称转录检测(FIATA)策略的RT-ddPCR并未出现假阴性结果。说明ddPCR在组织标本的ALK检测中也具有潜在的临床可行性[3]。
» 1.3 耐药监测
EGFR 20外显子的 T790M突变与第一、二代 EGFR-TKI 获得性耐药有关,约50%EGFR-TKI耐药的患者都具有EGFR-T790M突变。利用液滴dPCR检测了373例具有EGFR激活突变的NSCLC患者组织中EGFR-T790M突变的情况,结果显示,治疗前T790M突变的总发生率为79.9%,频率为0.009%~26.9%,由于大多数治疗前T790M突变频率低于0.1%,临床上常规检测方法无法检测到,因此dPCR更适合于微量样品的T790M突变检测,有潜力作为高灵敏度的诊断工具[4]。
用于个体化治疗的选择虽然组织标本对于研究EGFR-TKIs的耐药机制十分重要,但是对于有些NSCLC患者来说,获取组织标本十分困难,并且组织标本的连续获取对患者来说创伤性也很大,研究报道血浆 ctDNA可用来检测 T790M突变,可作为二次活检组织标本不可获取的替代标本,同时也可以是对组织检测结果的补充。肺癌患者血浆标本中ctDNA与肿瘤组织具有良好的一致性,具有连续、方便和微创的优势,但其在血浆中的含量很低,这对检测方法的敏感性提出了很高的要求。
Ishii等利用dPCR检测了NSCLC患者血浆中的T790M突变,检测的灵敏度和特异性分别为81.8%和85.7%,血浆和组织标本中突变的一致性高达83.3%。这表明dPCR可以作为高灵敏的检测方法用于血浆标本中T790M突变的检测,为耐药监测提供依据。Oxnard等利用液滴dPCR在NSCLC患者的血浆标本中通过对EGFR和KRAS基因突变定量检测,可以提前几周预测临床耐药性的发生,从而指导治疗[5-6]。
Tang等比较利用ARMS、Super-ARMS及ddPCR方法检测77例NSCLC患者的EGFR Ex19del、L858R、T790M的情况,结果显示dPCR相比ARMS具有更好的灵敏性(对于 Ex19Del & L858R,P = 0.002 ,对于 T790M,P < 0.001)[7]。
» 1.4 预后判断
研究显示,采用dPCR和ARMS方法监测了晚期NSCLC患者用EGFR-TKI治疗6个月后的生存情况,结果显示dPCR对于ctDNA中EGFR T790M突 变 的 检 测 限 为0.03%,在TKI治疗前后的血浆标本中dPCR检测到的T790M突变频率均高于ARMS,并且与TKI治疗前不具有T790M突变的患者相比,T790M突变患者的无进展生存时间和总生存时间更差。说明通过dPCR检测ctDNA中T790M突变可以为EGFR-TKI预后提供一种非侵入性和灵敏的检测方法[8]。
Kras是一种致癌驱动基因,30%的NSCLC患者都有Kras基因突变,并且该基因突变与预后不良相关。Guibert等利用dPCR检测32例肺腺癌患者血浆cfDNA的研究结果显示,cfDNA中Kras基因突变的检测可以作为治疗反应差的预测因子[9]。
2. 与其他传统扩增技术相比,dPCR在肺癌临床诊断常规使用中有何优势?
» 2.1 高灵敏度
与传统荧光定量PCR技术相比,dPCR的灵敏度更高,更适合常规临床使用。dPCR的原理是将标准PCR反应体系分配至大量微小的反应单元中,这能大大提高PCR反应体系对抑制物的耐受能力。传统的扩增技术的灵敏度只有1%,但dPCR可轻松实现单分子检测,灵敏度可达0.1%甚至0.001%。
» 2.2 可以绝对定量
实时定量PCR技术只能得到定性结果,其分析结果高度依赖于标准曲线或者内参基因,无法做到精准绝对定量。不管是芯片式还是液滴式的dPCR,其基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微腔室或微滴中,每个微反应单元可能有核酸模板(1个或多个),也可能没有(0个)。经过PCR循环之后,只要有一个核酸分子模板的微反应单元就会给出荧光信号,没有核酸分子模板的微反应单元就没有荧光信号。在结果判读时仅判断“有/无”两种扩增状态,通过直接计数或泊松分布来进行定量分析,实现了真正意义上的绝对定量。特别适用于拷贝数变异、突变检测等依靠Ct值不能很好分辨的应用领域。
» 2.3 操作简易,便于实验室开展
与NGS相比,dPCR对实验室设施相对要求低,操作流程简易,报告时间快速,便于临床实验室工作的开展。dPCR由于标本用量少,高敏感性、高特异性的特点,克服了肿瘤组织包埋标本DNA质量差、标本量有限等主要问题,为临床检测多种癌症基因突变提供更客观、自动化程度更高的定量检测结果。在荧光定量PCR过程中影响扩增效率的因素众多,比如酶、引物水平、PCR抑制物等,不能保证Ct值的恒定性,重复性较差。而dPCR通过终点荧光信号计算浓度,不依赖于Ct值,因此不受扩增效率影响,能够将误差控制在5%以内,实现检测结果的高度重复性,使得批次之间和实验室之间的结果具有良好的可比性。
3. 现有的商业化dPCR平台的比较
» 3.1 Bio-RAD
Bio-RAD公司 QX200 微滴式dPCR系统采用“油包水”原理,每次可以生成20,000个左右微液滴。其产品进入市场较早,性能较为稳定。
» 3.2 ThermoFisher 3D dPCR
ThermoFisher的QuantStudio 3DdPCR系统是一款基于芯片的仪器,能够在每次运行中多产生20,000个0.8nL液滴,满足了目前大部分dPCR应用的需求。还具有可扩展性的芯片容量。工作流程简单方便,仅需简单加样并封膜即可进行 PCR 分析,能同时完成 24 块芯片的热循环步骤。
» 3.3 QIAGEN dPCR
QIAGEN的QIAcuitydPCR系统,纳米芯片采用微流体技术,在芯片中加入反应混合液后放入QIAcuity系统中,仪器自动将样品压入微流体芯片的纳米小孔中并对每个小孔独立密封。芯片技术保证分配到每个纳米小孔中液滴大小均一,避免交叉污染。拥有5色荧光检测通道及1通道的参比荧光通道,最高可容纳8块芯片(768样本)的处理通量。
» 3.4 国产新羿dPCR
作为具有我国独立知识产权的新羿TD-1 dPCR平台在性能指标上与Bio-RAD、ThermoFisher产品相比也非常具有竞争力,在两个关键性能方面有突出表现:一是微滴读取仪首创了“准共聚焦”光路系统,极大地降低了背景干扰,显著提高了信噪比和区分度,保证了结果的可靠与准确;二是芯片结构设计实现全过程一键式微液滴生成,无手动微液滴转移过程;微液滴检测过程全程封闭,无PCR污染,30微升样本可制备约5万个液滴,能够提供较高的检测精度和线性范围。
总的来说,常见的dPCR主要有基于微滴式dPCR(droplet dPCR,ddPCR)和芯片式dPCR(chip dPCR,cdPCR)技术。由于芯片式dPCR制造芯片的成本较高,目前微滴式dPCR正越来越受到企业的认可。dPCR的发展方向包括:(1)提高检测通量;(2)提高检测自动化程度;(3)提高检测速度;(4)提高检测动态范围;(5)降低检测成本。
4. dPCR进入临床前还有哪些问题仍需解决?
» 4.1性能确认
性能确认方面,dPCR属于实验室自建检测方法,正式进入临床使用前,临床实验室应进行全面的性能确认。临床指南和建议的缺失使得各实验室间对性能确认的要素和判断标准存在差异,导致临床使用结果的差异,因此不同分液原理的dPCR平台间需要进行检测结果比对。各种dPCR方法与传统检测方法之间的检测结果的一致性也需要大量的比对和验证实验。只有如此,才能保证dPCR技术可以成熟地进入临床检测[10]。
dPCR每个反应单元的体积有限,不利于长片段序列的扩增,需将扩增片段控制在适当的长度。此外,dPCR技术极其灵敏,需要特殊的技术设计进行防污染管理,要尽量避免微液滴和外界环境接触的机会,做到不开盖扩增检测,减少假阳性。以上局限性在某种程度上影响了数字PCR在临床上的常规应用。
» 4.2国家和行业标准
dPCR临床检测尚无国家或行业统一标准,且缺乏商品化的室内质控品,因此需要建立适宜的室内质控措施,建立规范化的标准检测分析流程。dPCR的灵敏度较高,操作过程极易受到外源污染,因此做好实验室内部质量控制,建立规范标准的检测操作流程和结果评估分析体,是保证检测结果准确性和可靠性的前提。
» 4.3 人员培训
dPCR操作对技术要求相对较高,需要加强人员培训。因为dPCR的灵敏度很大程度上取决于生成的反应单元的数目,而反应单元的生成数目比如微滴式dPCR的微滴生成数则高度依赖于技术人员的操作熟练程度,目前多数dPCR尚不能很好地实现自动化,因此对技术人员的操作培训尤为重要;结果报告方面,如何合理地审核和报告低丰度的检测结果,也是临床实验室在临床实践前需要考虑的要点。
随着对实验方法的不断研究,dPCR技术会进一步完善和发展,相信dPCR技术具有广阔的应用前景,有望成为基因研究的前沿技术,并可在不久的将来作为常规技术用于临床。
参考文献
[1] 数字PCR在肺癌诊疗中的应用研究,重庆医学,2019,48(22):3879-3882
[2] Tony K F Yung, K C Allen Chan, Tony S K Mok,et al.Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients,Clin Cancer Res, 2009 Mar 15;15(6):2076-84.
[3] Yuanyuan Liu, Shafei Wu, Xiaohua Shi et al.ALK detection in lung cancer: identification of atypical and cryptic ALK rearrangements using an optimal algorithm,J Cancer Res Clin Oncol,2020 May;146(5):1307-1320
[4] Hidenobu Ishii, Koichi Azuma, Kazuko Sakai et al.Digital PCR analysis of plasma cell-free DNA for non-invasive detection of drug resistance mechanisms in EGFR mutant NSCLC: Correlation with paired tumor samples,Oncotarget,2015 Oct 13;6(31):30850-8.
[5] Geoffrey R Oxnard, Cloud P Paweletz, Yanan Kuang, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA,Clin Cancer Res,2014 Mar 15;20(6):1698-1705.
[6] Chuanhao Tang, Lingxiang Zhu, Lijuan Zhang, et al.Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients,Clin Chim Acta,2020 Jul 6;510:88-96.
[7] Shirong Zhang, Lucheng Zhu, Bing Xia,et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation identified in plasma indicates failure sites and predicts clinical prognosis in non-small cell lung cancer progression during first-generation tyrosine kinase inhibitor therapy: a prospective observational study,Clinical Trial Cancer Commun (Lond),2018 May 22;38(1):28.
[8] Nicolas Guibert, Anne Pradines, Magali Farella et al.Monitoring KRAS mutations in circulating DNA and tumor cells using digital droplet PCR during treatment of KRAS-mutated lung adenocarcinoma,Lung Cancer,2016 Oct;100:1-4.
[9] 关明, 郭玮, 刘维薇,数字PCR的临床应用和挑战, 国际检验医学杂志,2019,7(40):1665-1668
[10] Masaru Watanabe, Tomoya Kawaguchi, Shun-ichi Isa et al. Ultra-Sensitive Detection of the Pretreatment EGFR T790M Mutation in Non-Small Cell Lung Cancer Patients with an EGFR-Activating Mutation Using Droplet Digital PCR, Clin Cancer Res,2015 Aug 1;21(15):3552-60.