肠癌类器官培养基

　　1. 肠癌类器官培养

　　将获取的肠癌原代细胞悬液计数，根据计算好的体积吸取细胞悬液加入预冷的1.5 mL离心管中，补齐预冷的肠癌类器官培养基至所需体积，将预冷后的细胞悬液加入等体积的Matrigel(Corning)中轻轻混匀(全程冰上操作)，避免气泡，使得肠癌原代细胞终浓度为5X105个细胞/毫升。然后将细胞与基质胶的混合液按照50-60 μL/孔呈半球形点胶于24孔板。将培养板放入5%CO2、37℃培养箱终至少30 min，待Matrigel完全凝固。沿孔壁每孔缓慢加入500 μL预先恢复至室温的类器官培养基，置5%CO2、37℃培养箱培养。3天后镜下观察类器官形成情况，粒径大于30~50 μm即认为类器官已经形成，每5天更换一次培养基进行培养，持续观察类器官大小，镜下观察大部分类器官大小均大于30~50 μm且大小不再增大即可收集类器官进行后续实验。

　　2. 肠癌类器官收集

　　弃培养基，每孔加入500 μL预冷DF12，反复吹打至基质胶完全脱离板底，收集至15 mL离心管中，1500 rpm离心5 min，轻轻吸去上清和基质胶层，待用。

　　3. 肠癌类器官传代

　　收集的类器官，加入3-5 mL类器官解离试剂（PRS-ODR），37℃，200 rpm水平摇床振荡消化（具体时间根据类器官大小和数量决定，以肉眼可见颗粒明显减小一半为准，可中间取消化的类器官显微镜观察，类器官消化至包含有3~10个细胞的细胞团块最佳）；消化完全后采用等体积的含10% FBS的DMEM培养基终止消化。1500 rpm离心3 min，弃上清，使用清洗液重悬沉淀后1500 rpm再次离心3 min；加入预冷的胃癌类器官培养基进行重悬，计数，按照培养步骤操作继续培养。