技术简介根据目的基因外显子序列设计并合成sgRNA,将Cas9和sgRNA质粒共转染目的细胞

技术简介
根据目的基因外显子序列设计并合成sgRNA,将Cas9和sgRNA质粒共转染目的细胞，通过sgRNA引导Cas9核酸酶对目的基因靶位点进行切割，引起DNA双链断裂（Double-strand breaks DSB),通过细胞自身的非同源末端修复（Non-homologous end joining， NHEJ)途径造成目的基因编码区碱基的随机缺失或插入，若缺失或增加的碱基数为非3倍数，则引起目的基因发生移码突变，进而实现目的基因敲除。

应用范围

1	2
可实现大部分编码基因的敲除，尤其是需敲除的目的基因存在重合基因或有邻近基因存在时	不适用非编码基因和存在多个转录本的编码基因

方案选择

1	2	3
拥有质粒瞬转和慢病毒感染两种传送方式，可实现大多数细胞系和干细胞的基因编辑	拥有多种荧光筛选标记，结合流式分选，可提高获得阳性目的细胞的概率	在细胞不产生耐药的情况下，可提供多种药筛标签，满足不同实验需求

应用案例

细胞名称：C3H10T1/2

基因名称：Piezo1

项目方案：构建Cas9和sgRNA过表达慢病毒，感染目的细胞，通过流式分选GFP和mCherry阳性细胞，挑选单克隆，经鉴定后进行扩增，得到Piezo1基因移码敲除的单克隆细胞株。

胞鉴定：通过对流式分选筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定，Piezo1基因第4外显子中产生1个碱基缺失，并在第4外显子中提前形成终止密码子，无法翻译正确蛋白，Piezo1基因在功能上达到敲除的效果。

项目流程与周期

交付标准

1	2	3
按指定方案构建的目的基因编辑细胞株，每个目的细胞株交付基因型正确的2个克隆，每个克隆2支冻存细胞（1*10ªcells/支）	对照细胞株，瞬转方案为对应野生型细胞，慢病毒方案为Cas9稳转细胞	项目报告及质检报告