1、 脱蜡:切片放入二甲苯1,二甲苯2,二甲苯3,各10分钟,无水乙醇1,无水乙醇2,无水乙醇3各2分钟,流水冲洗5分钟。
2、 修复:高压锅内加入2000毫升柠檬酸钠修复液,加热至沸腾后将切片放入并加盖,压力阀转动后开始计时3分钟,自然冷却至室温。
3、 洗涤:Pbs洗涤3次,每次5分钟。
4、 阻断:3%过氧化氢室温阻断10分钟。
5、 洗涤:Pbs洗涤3次,每次5分钟。
6、 封闭:2.5%山羊血清室温封闭1小时,甩去封闭液再加入一抗,4度过夜。
7、 洗涤:Pbs洗涤3次,每次5分钟。
8、 二抗:加入对应二抗,室温孵育30分钟。
9、 洗涤:Pbs洗涤3次,每次5分钟。
10、 显色:dab显色1-2分钟,显微镜下观察至有明显阳性,用去离子水终止反应。
11、 复染:苏木素复染2分钟,再用流水冲洗。
12、 分化:盐酸乙醇分化1-2秒,再用流水冲洗。
13、 蓝化:稀氨水蓝化10秒,再用流水冲洗。
14、 脱水:75%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,无水乙醇1,无水乙醇2梯度脱水,每次5分钟。
15、 透明:二甲苯1,二甲苯2,二甲苯3透明,每次5分钟。
16、 封片:中性树胶封片后,烘箱中烤干,显微镜下观察。
实验试剂
1,柠檬酸钠修复液 货号:自配液
2,PBS 货号:自配液
3,山羊抗兔二抗 货号:vector mp-7452
4,dab 货号:中杉金桥 zli-9018
一抗:
α-sma 货号:ab124964 实验比例:1:1000